Estandarización de una PCR anidada para la identificación de Lawsonia intracellularis en porcinos
Universidad Cooperativa de Colombia. Sede Bucaramanga.
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Se estandarizó una técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR anidada para el diagnóstico de la enteropatía proliferativa porcina causada por la bacteria Lawsonia intracellularis. La técnica se basó en la amplificación de una región de 270 pb del gen 16s arnr de Lawsonia intracellularis; para tal fin, se extrajo el adn de la bacteria mediante el kit Purelink Genomic, Invitrogen®, a partir de 100 muestras de íleon de porcinos provenientes del área metropolitana de Bucaramanga (Santander). Los adn fueron cuantificados por fluorometría y ajustados a una concentración de 20 ng/µL. Se llevó a cabo una primera amplificación de la porción de 319 pb del gen 16s arn con los iniciadores externos: 5’-tat ggc tgt caa aca ctc cg-3’ y 5’-tga agg tat tgg tat tct cc-3’. El producto de esta primera amplificación se usó de molde para una segunda reacción, en la que se amplificó una porción interna de 270 pb del gen 16s arn de L. intracellularis, empleando los iniciadores internos específicos: 5’-tta cag gtg aag tta ttg gg-3’ y 5’-ctt tct cat gtc cca taa gc-3’. Las condiciones óptimas para las pcr tanto con los iniciadores internos como con los externos incluyeron: 2,5 mm de mgcl2; 0,15 mm de cada dntp; 1x de Buffer de reacción; 0,8 µm de cada iniciador; y 2,5 U de Taq polimerasa. Como control positivo tanto en la extracción de adn como en las pcr, se empleó ADN bacteriano extraído de la vacuna Enterisol® (Boheringer Ingelheim®). Las temperaturas óptimas de anillamiento para la pcr simple y anidada fueron de 50 y 55°C, respectivamente. El límite de detección de la técnica fue de 5 fg. La técnica no evidenció reacción cruzada con Esquerichia coli, ni con Salmonella typhimurium, bacterias con cuadros clínicos semejantes.
